CHƯƠNG
3
CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA SỰ DI TRUYỀN
Quá trình sống được điều
khiển bằng sự truyền thông tin chi tiết và
chính xác. ADN
chứa tất cả thông tin cần thiết để
xây dựng và điều hành hoạt động cơ
thể, làm cho từ một tế bào chưa chuyên hóa
trở thành mô và cơ quan, trong đó các tế bào
được chuyên hóa tùy theo chức năng.
Sự truyền đạt thông tin di truyền
diễn ra theo hai hướng.
Một là các thông tin trong ADN được dùng
để xây dựng tế bào và điều khiển
các phản ứng sinh hóa. Hai
là bộ thông tin nầy được nhân đôi và
được chuyển vào mỗi tế bào con:
hoặc tế bào dinh dưỡng hoặc tế bào sinh
dục (tinh trùng và trứng).
Như vậy chính thông tin nầy làm cho sự
sống nối tiếp nhau trong đời sống
của sinh vật và từ thế hệ nầy sang
thế hệ khác.
Ngày nay chúng ta biết rằng gen là các trình
tự của ADN mã hóa cho protein.
Các gen được xếp thành hàng trên một
hoặc nhiều nhiễm sắc thể, tập hợp
lại gọi là bộ gen (genome).
Trong chương nầy, chúng ta sẽ bắt đầu
từ cấu trúc của ADN, sau đó khảo sát quá trình
nhân đôi của nhiễm sắc thể, gọi là
sự sao chép (replication). Quá
trình nầy bao gồm cả sự tự sữa
chửa những khuyết điểm sao chép, làm cho
mỗi tế bào con được tạo thành trong
sự phân bào nhận được một bản sao
của mỗi nhiễm sắc thể (và cũng là nguyên
bộ gen) từ tế bào bố mẹ.
I.
BẢN CHẤT CỦA VẬT LIỆU DI TRUYỀN
|
|
Năm
1868 F. Miescher (nhà sinh hóa
học Thụy Sĩ) nhận thấy khi dùng pepsin để
phân hủy các protein trong tế bào thì nhân tế bào
bị co lại nhưng vẫn còn nguyên vẹn.
Tiếp tục thí nghiệm với nhân nầy (đã
xử lý men tiêu hóa pepsin) bằng cách dùng nhiều
loại thuốc thử khác nhau thì thấy nó phản
ứng không giống như protein và phát hiện nó có
chứa P ngoài các nguyên tố C, H, O, N cấu tạo
protein. Như vậy,
những kết quả nầy cho thấy nhân chứa
một lượng lớn vừa là protein vừa là
hợp chất không phải protein.
Miescher gọi hợp chất không phải protein
nầy là nuclein, về sau được đặt tên
là acid nhân (nucleic acid). Các
nghiên cứu sau nầy cho thấy, acid nhân không chỉ
có trong nhân tế bào mà còn có cả trong tế bào
chất. Loại acid nhân
do Miescher phát hiện là ADN (Deoxyribonucleic Acid).
Năm
1914 R. Feulgen (nhà hóa
học người Ðức) tìm ra phương pháp
nhuộm nuclein bằng phẩm crimson sáng (brilliant crimson).
Mười năm sau Feulgen áp dụng phương
pháp nầy nhuộm cả tế bào thì thấy
rằng ADN của nhân có ở nhiễm sắc thể.
Từ đó phương pháp Feulgen được
dùng để xác định lượng ADN trong nhân
của nhiều loại tế bào.
Nhờ đó các nghiên cứu đã chứng minh
rằng tất cả các tế bào dinh dưỡng
của một cá thể có cùng một lượng ADN dù
đó là tế bào của những mô khác nhau như
gan, thận, tim, cơ... trong khi những chất khác hơn
ADN có số lượng thay đổi rất lớn.
Sau đó người ta cũng khám phá ra tế bào
trứng và tinh trùng chỉ có 1/2 lượng ADN so
với tế bào dinh dưỡng.
Các khám phá nầy đã đưa đến
nhận định rằng ADN là chất liệu chính
của gen. Thật ra thì
nhiễm sắc thể chứa cả protein và ADN và do cơ
cấu hóa học của protein rất phức tạp nên
nhiều người nghĩ rằng chỉ có protein
mới đủ sức mã hóa cho mọi thông tin di
truyền ở sinh vật.
|
|
a.
Thí nghiệm của Griffith
Năm
1928 F. Griffith (nhà vi sinh
vật y học người Anh) tiến hành các thí
nghiệm với vi khuẩn Pneumococci gây bệnh sưng
phổi (pneumonia). Ông thí
nghiệm trên chuột để tìm hiểu ảnh hưởng
của hai chủng gây bệnh và không gây bệnh.
-
Chủng gây bệnh: có vỏ bao bằng đường
đa, tạo khuẩn lạc láng (smooth) nên được
ký hiệu là chủng S.
-
Chủng không gây bệnh: không có vỏ bao,
tạo khuẩn lạc sần (rough) nên được
ký hiệu là chủng R.
Griffith
nghiên cứu ảnh hưởng của hai chủng
nầy khi tiêm chúng vào chuột..
Kết quả là:
-
Chuột được tiêm chủng R sống (
chuột còn sống.
-
Chuột được tiêm chủng S sống (
chuột bị chết.
-
Chuột được tiêm chủng S chết (do
xử lý nhiêtû) ( chuột còn sống.
- Chuột được tiêm chủng S chết + chủng R sống ( chuột bị chết.
Kết quả thật khó hiểu! Làm thế nào
một hỗn hợp của một chủng không gây
bệnh với một chủng gây bệnh đã
chết lại làm chết chuột ? Griffith khảo sát
các cơ thể chuột chết và phát hiện
thấy chúng chứa đầy chủng S còn sống!
Chủng nầy đến từ đâu ? Griffith cẩn
thận lặp lại nhiều thí nghiệm và đi
đến kết luận là bằng cách nào đó
chủng R sống đã biến đổi thành
chủng S sống với nguyên liệu của tế bào
chủng S chết. Ðem
cấy chủng S nầy (đã biến đổi) chúng
phát triển thành chủng S mới.
Như vậy, có thể giả định
rằng vật liệu di truyền từ chủng S
chết đã thâm nhập vào chủng R sống (không gây
bệnh) và biến đổi chúng thành chủng S gây
bệnh. Hiện tượng
nầy về sau được gọi là sự
biến nạp (transformation).
Năm 1931 một số tác giả khác đã cho
thấy rằng sự biến nạp vi khuẩn không
chỉ xảy ra trong cơ thể chuột mà còn
thực hiện được trong ống nghiệm.
Hai năm sau J. L.
Alloway (viện Rockefeller) đã chứng minh rằng
trong ống nghiệm, tế bào của chủng R
sống có thể bị biến nạp thành chủng S
bởi một chất trích từ chủng S.
Như vậy, rõ ràng các
đặc tính di truyền của chủng gây bệnh
đã được chuyển sang chủng không gây
bệnh bằng một số chất không bị
ảnh hưởng bởi xử lý nhiệt và sự
ly trích tế bào (hóa học, cơ học...).
Ðến năm 1944 O.T. Avery,
C. MacLeod và M.
McCarty (viện Rockefeller) bằng kỹ thuật tinh
khiết hóa ADN đã chứng minh rằng tác nhân gây ra
sự biến nạp là ADN.
Kết quả nầy là một bằng chứng
rạch ròi rằng không phải protein hay một
phức hệ nucleo-protein mà chính ADN mới là vật
liệu di truyền. Tuy
nhiên ở thời điểm đó điều nầy
vẫn chưa thuyết phục được nhiều
nhà sinh học. Họ
cho rằng ADN của chủng gây bệnh có lẽ
hoạt hóa gen tổng hợp protein của chủng không
gây bệnh.
b.
Thí nghiệm của Hershey và Chase
Trong
suốt 10 năm kế tiếp có ít nhất 30 thí
nghiệm khác nhau về sự biến nạp vi
khuẩn bằng ADN tinh khiết đã được mô
tả. Nhưng bằng
chứng vững vàng lại đến từ phòng thí
nghiệm di truyền Carnegie
với những nghiên cứu của A.D.
Hershey và M. Chase
(1952) trên một loại siêu khuẩn tấn công vi
khuẩn Escherichia coli (E.coli).
Loại siêu khuẩn nầy được gọi
là thực khuẩn (bacteriophage), gọi tắt là phage (có
nghĩa là ăn).
Thực
khuẩn là những ký sinh cực nhỏ nhưng chúng
bắt buộc bộ máy tế bào của ký chủ
sản sinh ra gen của chúng.
Chúng có cấu tạo đơn giản gồm
một lớp vỏ protein và một lõi acid nhân.
Lớp vỏ protein của chúng được chia
thành vùng đầu (chứa vật liệu di
truyền) và vùng đuôi dài bao gồm 1 lõi rỗng, 1
bao và 6 sợi tận cùng (Hình 1).
|
|
| Hình 1. Cơ cấu của một thực khuẩn |
Khi
1 phage tấn công một tế bào vi khuẩn, nó bám vào
vách tế bào vi khuẩn bằng đầu mút của
các sợi và đế. Sợi
đuôi và đế chứa một protein gắn vào
một thành phần đặc biệt của vách.
Sau 1 giờ các phage mới xuất hiện bên trong
vi khuẩn. Ở
một thời điểm thích hợp, phage hoạt hóa
gen mã hóa enzim tiêu hóa gọi là lysozim và các enzim khác.
Kết quả là tế bào vi khuẩn vở ra,
giải phóng hàng chục đến hàng trăm phage
mới vào môi trường chung quanh.
Các phage mới nầy đều có cấu trúc di
truyền giống như phage
ban đầu. Như
vậy vật liệu di
truyền
Phage bám vào vách tế bào và chính vật liệu nầy điều khiển bộ máy biến dưỡng của vi khuẩn sản xuất các gen cho phage mới cũng như protein cần thiết cho vỏ phage và các enzim ngăn cản sự tổng hợp protein cho vật chủ và khi đúng lúc tiêu hủy tế bào vi khuẩn. Hershey và Chase bố trí một thí nghiệm để xác định xem phage chỉ tiêm vào vi khuẩn ADN hay protein hoặc cả hai. Chúng ta biết rằng ADN có chứa P mà không có S còn protein thì ngược lại nên có thể phân biệt ADN và protein khi dùng chất đồng vị phóng xạ của P và S.
Ðó là P32 và S35 (Dùng chất đồng vị phóng xạ để theo dõi một chất nào đó trong quá trình sinh học, gọi là sự đánh dấu)
Thí nghiệm như sau:
Cho nhiễm phage vào vi khuẩn nuôi trên môi trường có P32 và S35 . Phage mới (trong vi khuẩn) có S35 ở protein và P32 ở ADN
|
|
| Hình
2. Thí
nghiệm của Hershey và Chase |
A.
Cho phage không đánh dấu vào môi trường nuôi
vi khuẩn có P32 và S35.
B.
Phage mới phát triển kết hợp P32 trong ADN và
S35 trong protein.
C. Cho phage đã
được đánh dấu vào môi trường nuôi
vi khuẩn không có đồng vị phóng xạ.
D. Vi khuẩn bị
nhiễm phage được làm lạnh trước khi
phage mới có thể phát triển.
E. Lắc để tách
vỏ phage ra khỏi vi khuẩn.
F-G. Hỗn hợp
được ly tâm để tách vỏ phage ra
khỏi vi khuẩn.
H.
Phần lỏng gồm vỏ phage có S35.
Phần cặn gồm vi khuẩn với ADN của
phage có P32.
-
Cho nhiễm phage có phóng xạ vào vi khuẩn không có phóng
xạ. Ðể đủ
thời gian cho phage bám vào vách tế bào vi khuẩn và
tiêm chất liệu di truyền vào.
- Lắc và sau đó ly tâm để tách rời
vỏ của phage và vi khuẩn bị nhiễm.
Kết
quả cho thấy phần lỏng sau ly tâm chứa
một lượng lớn 
và một ít 
. Ðó là vỏ protein
của siêu khuẩn bỏ lại ngoài
vách tế bào vi khuẩn, còn phần cặn có
chứa một lượng lớn 
và một ít 
.
Ðiều nầy chứng tỏ chỉ có ADN
của phage được đưa vào trong tế bào
vi khuẩn. Phage mới
được sản xuất trong vi khuẩn nên
chỉ ADN của phage đã đủ sức truyền
mọi thông tin cần thiết để vi khuẩn
tạo ra phage mới (Hình 2).
Tóm lại thí nghiệm nầy là một bằng chứng mạnh mẽ hổ trợ cho các kết luận trước đó về sự biến nạp: chính acid nhân (chứ không phải protein) là vật liệu di truyền.
|
|
Phân
tử ADN gồm những đơn vị gọi là
nucleotid. Mỗi nucleotid
gồm 1 phân tử đường 5C, 1 nhóm phosphat và 1
baz có N. Theo qui ước,
5 carbon của đường được đánh
số từ 1 đến 5. (Hình
3).
Hình
3. Sơ đồ
cấu trúc của một nucleotid
Có 4 loại nucleotid khác nhau bởi các baz N.
Hai baz Adenin và Guanin là các purin, có cấu trúc vòng
đôi, còn Timin và Cytosin là các pyrimidin có cấu trúc vòng
đơn (Hình 4).
PURIN
PYRIMIDIN
Hình
4. Công thức cấu
tạo của 4 loại nucleotid
Trong phân tử ADN các nucleotid được
sắp xếp theo một trình tự đặc
biệt: các phân tử đường nối với
nhau bởi các nhóm phosphat liên kết với C3 của
đường nầy và với C5 của đường
kế tiếp thành chuỗi, các baz N được
sắp xếp phía ngoài chuỗi.
Phân tử ADN thường gồm 2 sợi
được nối với nhau bằng liên kết
hydro giữa các baz (cơ cấu bậc thang).
Những liên kết nầy chỉ xảy ra
giữa cytosin và guanin hoặc giữa timin và adenin.
Do vậy, trình tự của các baz trên sợi
nầy xác định trình tự bổ sung trên sợi
còn lại (Hình 5). Cần
lưu ý rằng sự phân cực của hai sợi là
ngược chiều nhau: 1 sợi từ 5 đến 3,
1 sợi từ 3 đến 5.
Phân tử sợi đôi xoắn lại làm thành
cấu trúc xoắn kép nhờ các liên kết hydro (Hình
6).
Hình
5. Những cầu
nối các baz giữa các nucleotid
|
|
Việc
xác định cấu trúc của một phân tử
phức tạp và quan trọng như ADN đã trở thành
một thách thức lớn đối với nhiều
nhà khoa học. Trong năm
1950 hầu như người ta chưa biết
gì về
sự sắp
xếp trong không gian
của các nguyên
tử trong phân tử ADN cũng
như là
không biết làm
thế nào phân tử nầy có thể chứa đựng
thông tin cần thiết để tự nhân đôi và
điều khiển các chức năng của tế bào.
Vào khoảng thời gian nầy nhiều nhà khoa
học bắt đầu ứng dụng kỹ thuật
phân tích sự nhiễu xạ tia X để nghiên
cứu ADN. Nổi
bật trong số đó là R.
Franklin và M. H. F. Wilkins
(Ðại học King, Anh quốc).
Họ đã thành công trong việc tạo ra
những mẫu nhiễu xạ tia X sắc nét hơn
những mẫu đã có từ trước.
F. H.
C. Crick (Ðại
học Cambridge) dùng phương pháp toán học để
phân tích các ảnh nhiễu xạ ADN (của Franklin và
Wilkins) đã cho thấy tinh thể ADN phải là một
xoắn với 3 chu kỳ chính có lặp lại là 0,34
nm ; 2,0 nm và 3,4 nm.
Từ những gì đã biết về thành
phần hóa học của ADN, những thông tin về
nghiên cứu sự nhiễu xạ tia X của ADN,
về khoảng cách chính xác giữa các nguyên tử liên
kết nhau trong phân tử, các góc giữa các liên
kết và kích thước của các nguyên tử,
J. D. Watson và F. H.
C. Crick (Ðại học
Cambridge) quyết tâm xây dựng một mô hình cấu trúc
của phân tử ADN. Họ
xây dựng mô hình theo tỉ lệ của các thành
phần cấu tạo ADN rồi tìm cách lắp đặt
chúng với nhau sao cho phù hợp với các kết
quả thu được từ tất cả các nghiên
cứu trên.
Họ xác định được chu kỳ 0,34
nm tương ứng với khoảng cách giữa 2
nucleotid kế tiếp nhau trong sợi ADN, chu kỳ 2,0 nm
là chiều rộng của xoắn và chu kỳ 3,4 nm là
khoảng cách giữa các xoắn trong sợi.
Vì 3,4 nm bằng 10 lần khoảng cách giữa 2
nucleotid kế tiếp nhau nên mỗi xoắn có 10
cặp nucleotid.
Trên những dữ liệu về nhiễu xạ
tia X, Watson và Crick tính toán thấy rằng một
sợi nucleotid quấn xoắn, chiều rộng của
xoắn là 2,0 nm và mỗi xoắn dài 3,4 nm thì sợi có
tỉ trọng bằng 1/2 tỉ trọng của ADN.
Do vậy ADN phải gồm 2 sợi nucleotid hơn
là một sợi. Họ
sắp xếp lại mô
hình tỉ lệ và sau cùng mô hình phù hợp với
tất cả những dữ liệu được tìm
ra là: phân tử ADN gồm 2 sợi nucleotid quấn theo 2
hướng ngược nhau quanh một trục giả
định có đường kính chính xác, các baz purin
và pyrimidin hướng về phía trong của trục.
Theo cách nầy các liên kết hydro giữa các baz
trên hai sợi quấn ngược chiều nhau mới
đủ sức giữ 2 sợi ở trạng thái
xoắn. Nói cách khác,
khi phân tử ADN mở xoắn thì giống như
một cái thang, 2 trụ thang tương đương
với 2 sợi gồm đường và nhóm phosphat xen
kẻ nhau còn các thanh ngang là các cặp baz liên kết
nhau bằng cầu nối hydro (Hình 7).
|
|
Hình 6. Một phần của phân tử ADN Hình 7. Mô hình cấu trúc của ADN
Về
mặt cấu trúc, ARN cũng được cấu
tạo từ các nucleotid, giống như trong sợi
đơn của phân tử ADN.
Mặc dù ARN và ADN là những hợp chất
rất giống nhau, nhưng chúng vẫn khác nhau ở 3
điểm quan trọng :
Hình
8. So sánh Uracil trong ARN
với Timin trong ADN
(1) Ðường của ARN là riboz trong khi đường
của ADN là deoxyriboz.
(2) ARN có Uracil trong khi ADN có Timin (Hình 8)
(3) ARN thường là sợi đơn trong khi ADN
thường là sợi đôi.
Ngày
nay chúng ta biết rằng có 3 loại ARN chính : ARN thông
tin (mARN) mang thông tin cần thiết mã hóa cho trình
tự các acid amin đến ribô thể là nơi protein
được tổng hợp; ARN vận chuyển (tARN)
mang các acid amin đến ribô thể trong quá trình
tổng hợp protein và ARN ribô thể (rARN) là thành
phần cấu tạo nên ribô thể.
ARN
thông tin được tổng hợp trong nhân tế bào
từ khuôn mẫu của ADN, làm nhiệm vụ trung
gian truyền thông tin di truyền từ ADN trong nhân sang
protein được tổng hợp tại ribô thể
trong tế bào chất. Thành
phần nucleotid trong mARN rất biến đổi,
từ 150 đến hàng ngàn nucleotid, thời gian tồn
tại trong tế bào rất ngắn.
Năm 1957 M. Hoagland
& CSV (ở Harvard) đã chứng minh rằng mỗi
acid amin gắn vào một dạng ARN nào đó trước
khi đến ribô thể, từ đó gắn thêm các
acid amin khác để tạo chuỗi polypeptid.
Họ gọi loại ARN có nhiệm vụ
chuyển các acid amin đến ribô thể là ARN vận
chuyển (tARN). Hoagland
& CSV cũng đã kết luận rằng mỗi phân
tử tARN chỉ mang một phân tử acid amin, hoạt
hóa nó với năng lượng ATP và chuyên chở nó
đến ribô thể.
Những
nghiên cứu tiếp theo của các nhà khoa học khác
đã cho biết thêm về cấu trúc và chức năng
của tARN. Cho đến
nay người ta biết được rằng có ít
nhất một tARN chuyên biệt cho mỗi acid amin.
Thí dụ acid amin arginin chỉ kết hợp
với tARN chuyên vận chuyển arginin.
Nhưng tất cả các tARN đều có chung vài
đặc điểm cấu trúc : có từ 73-93
nucleotid, có cấu trúc sợi đơn được
gấp lại thành nhiều thùy, bên trong có các baz
tự bắt cặp nhau, trình tự tận cùng là CCA.
Khi 1 acid amin gắn vào tARN thì nó luôn luôn gắn vào
đầu nầy (Hình 9).
|
|
Hình 9. Cấu trúc của một ARN vận chuyển
|
|
|
|
Như
chúng ta đã biết (chương 1), mỗi ribô
thể gồm hai bán đơn vị lớn và nhỏ,
mỗi bán đơn vị là một phức hợp
của rARN, enzim và protein cấu trúc.
Ở nhóm sơ hạch và nhóm chân hạch, rARN có
cấu trúc đặc sắc: ở một đoạn
dài các cặp baz bổ sung xoắn lại nhờ các liên
kết hydro, tạo ra một hình dạng có nhánh và có
vòng. Mặc dù chức
năng của cấu trúc nầy vẫn chưa rõ, nhưng
có lẽ nó có vai trò quyết định đối
với hoạt động của ribô thể (Hình10).
IV.
SỰ SAO CHÉP CỦA ADN (REPLICATION)
Nếu
ADN là vật liệu di truyền, nó phải chứa thông
tin cần thiết để sao chép và kiểm soát các
cấu trúc và các hoạt động của tế bào.
Mô hình của Watson và Crick thỏa mãn ngay yêu
cầu thứ nhất.
Vì ADN của mọi sinh vật đều là
chất trùng phân từ 4 loại nucleotid nên sự khác
biệt chính giữa các ADN ngoài tổng số nucleotid là
trình tự sắp xếp của các nucleotid.
Vấn đề cơ bản được đặt
ra là nếu cung cấp đủ 4 loại nucleotid, cái gì
làm cho cơ chế sinh hóa hoạt động nghĩa là
kết hợp những nucleotid với nhau theo đúng trình
tự và số lượng đặc trưng của
ADN đã có trong tế bào ?
Watson và Crick cho rằng nếu 2 sợi ADN được tách ra bằng cách làm gãy các liên kết hydro giữa các cặp baz, mỗi sợi sẽ cung cấp tất cảí thông tin cần thiết để tổng hợp một sợi mới giống hệt như sợi được tách ra. Vì adenin luôn luôn nối với timin, guanin luôn luôn nối với cytosin nên trình tự của các nucleotid trên một sợi sẽ qui định trình tự của các nucleotid trên sợi bổ sung. Như vậy tách rời 2 sợi của phân tử ADN và dùng mỗi sợi làm khuôn để tổng hợp ra một sợi mới sẽ dẫn đến kết quả là tạo ra 2 phân tử sợi đôi giống hệt phân tử ban đầu.
|
|
Năm
1957 A. Kornberg và CSV (Ðại
học Washington, St Louis) đã tìm ra phương pháp
tổng hợp ADN trong ống nghiệm.
Họ ly trích từ tế bào E. coli một
phức hệ enzim có thể xúc tác sự tổng
hợp ADN. Ðó là ADN
polymeraz (enzim tạo ra sự trùng phân ADN).
Nguyên liệu dùng cho thí nghiệm là 4 loại
nucleotid đã được hoạt hóa bằng ATP và
được đánh dấu bằng carbon phóng xạ
(
).
Sau khi cho vào ống nghiệm các nguyên liệu, ADN
polymeraz, thêm ADN vào -vừa làm chất mồi (primer),
vừa làm khuôn (template)- và để ở nhiệt
độ thích hợp, họ phát hiện các ADN mới
có chứa 
:
như vậy các nucleotid đánh dấu đã tham gia
tạo ADN mới. Sự
tổng hợp ADN sẽ không xảy ra nếu ADN không
hiện diện ngay từ đầu phản ứng.
Kornberg cũng chứng minh rằng tỉ lệ
của A và T cũng như G và C trong ADN mới hoàn toàn
giống như trong ADN thêm vào.
Các thí nghiệm khác cũng cho thấy ADN mới
được tổng hợp hoàn toàn giống với
ADN ban đầu chứng tỏ ADN ban đầu đảm
nhận chức năng làm khuôn.
Tuy nhiên, thí nghiệm của Kornberg chưa thật
sự làm sáng tỏ cơ chế sao chép theo cách
của Watson và Crick đề ra.
Bằng chứng trực tiếp đến từ
thí nghiệm của M.S.
Meselson và F.W. Stahl
(Viện Công nghệ California) công bố năm 1958.
Meselson và Stahl nuôi nhiều thế hệ vi
khuẩn E. coli trên môi trường chỉ có nitơ
chứa đồng vị phóng xạ 
(Nitơ nặng) vì vậy tất cả các baz trong ADN
của các vi khuẩn nầy có chứa 
.
Sau đó thay đổi nguồn Nitơ đột
ngột từ 
sang 
.
Mẫu vi
khuẩn được thu hoạch trong từng
giai đoạn rồi ly trích ADN và đem ly tâm trong
khuynh độ tỉ trọng muối cesium chloride (CsCl)
(ở tốc độ 40.000-50.000 vòng /1 phút từ 48
đến 72 giờ) để tách các ADN có tỉ
trọng khác nhau.
Khi đem ly tâm ADN được ly trích từ các
tế bào vi khuẩn phát triển qua nhiều thế
hệ trong môi trường
, ADN
sẽ lắng xuống và tạo thành một vạch
ở đáy ống nghiệm.
Ngược lại, khi ly tâm các ADN được
ly trích từ các tế bào chỉ nuôi cấy trong môi
trường 
,
ADN sẽ nổi lên và tạo thành một vạch
ở phần trên ống nghiệm.
Một hỗn hợp của ADN nặng (chứa 
)
và ADN nhẹ (chứa 
)
khi ly tâm sẽ tách thành hai vạch: vạch phía dưới
tương ứng với ADN nặng và vạch phía trên
tương ứng với ADN nhẹ.
Hình
11. Thí nghiệm của
Meselson và Stahl
Thí nghiệm cho thấy khi các tế bào chỉ có
ADN nặng (cả hai sợi của ADN chỉ có
trong baz purin và pyrimidin) phân cắt 1 lần trong môi trường
thì ADN
của tế bào mới sẽ có tỉ trọng trung
gian giữa ADN nặng (chứa )
và ADN nhẹ (chứa 
)
nghĩa là ADN của tế bào mới có một nửa
và
một nửa 
Trong thí nghiệm tiếp theo, khi để cho các
tế bào chỉ có ADN nặng phân cắt hai lần
trong môi trường ,
các ADN của tế bào mới được đem ly
tâm sẽ tạo thành hai vạch: một vạch
ứng với ADN có tỉ trọng trung gian và một
vạch ứng với ADN nhẹ.
Ðiều nầy rõ ràng chứng minh 2 sợi ADN
bố mẹ đã tách ra và mỗi sợi đều làm
khuôn để tổng hợp một sợi mới
bổ sung (Hình 11).
|
|
Quá
trình sao chép của ADN là một quá trình phức
tạp: liên kết hydro giữa 2 sợi của ADN
phải bị phá vỡ, hai sợi mở xoắn tách
rời nhau, các nucleotid bổ sung bắt cặp với các
nucleotid trên sợi khuôn, các nucleotid mới phải liên
kết hóa trị để thành lập sợi mới.
Mỗi bước có sự tham gia của 1
loại enzim chuyên biệt, xảy ra một cách nhanh chóng
và chính xác. Sự sao
chép ADN ở nhóm sơ hạch và chân hạch có
những điểm giống nhau.
(chiều di chuyển của enzim trên sợi khuôn).
Như ta đã biết, hai sợi của ADN phân
cực ngược chiều nhau (một đầu
tận cùng bằng 
và một đầu tận cùng bởi nhóm OH vì
gắn với 
của đường.
Cấu trúc nầy ảnh hưởng như
thế nào đến sự sao chép? Enzim ADN polymeraz
chỉ có thể gắn thêm các nucleotid vào đầu
tự do 
của sợi ADN đang phát triển.
Như vậy, một sợi ADN mới chỉ có
thể được kéo dài ra theo chiều 
.
Hình
12. Ðiểm khởi
đầu sao chép ở vi khuẩn
Ở
vi khuẩn diểm khởi đầu là một đoạn
ADN có trình tự đặc biệt.
Các protein khởi đầu quá trình sao chép
của ADN (protein ADN B) nhận ra trình tự nầy và
gắn vào ADN. Sau đó
enzim topoisomeraz (còn gọi là ADN gyraz) tháo xoắn, enzim
rep tách rời hai sợi, tạo ra một chạc sao chép
(replication fork) hình chữ Y (Hình 12).
Ở các tế bào chân hạch có nhiều điểm
khởi đầu sao chép trên phân tử ADN.
Sau
khi hai phân tử topoisomeraz tách nhau ra từ điểm
khởi đầu, ADN bắt đầu tháo xoắn và
tách rời hai sợi dưới tác dụng của
enzim helicaz (một enzim hoạt động tại góc
của chạc sao chép). Sau
đó protein gắn sợi đơn
sẽ gắn vào dọc theo sợi ADN chưa
bắt cặp, giữ cho sợi khuôn nầy căng ra
cho tới khi các sợi bổ sung mới được
tổng hợp.
Sự kéo dài của sợi ADN mới tại
chạc sao chép được xúc tác bởi một
phức hệ enzim gọi là ADN polymeraz III.
Từng nucleotid lần lượt được
gắn vào sợi ADN mới làm cho sợi nầy dài ra.
Ở vi khuẩn tốc độ gắn các
nucleotid là khoảng 500 nucleotid/s, ở người
khoảng 50 nucleotid/s.
Trên
một sợi khuôn, ADN polymeraz III gắn chặc vào
chạc sao chép, di chuyển dọc theo sợi khuôn và
tổng hợp một sợi bổ sung liên tục
bằng cách kéo dài sợi ADN mới theo chiều 
.
Sợi ADN được tổng hợp theo cơ
chế nầy được gọi là sợi sớm
(leading strand). Ðể kéo
dài sợi mới còn lại, enzim polymeraz phải di
chuyển dọc theo sợi khuôn từ phía trong chạc
ra ngoài (
).
Sợi ADN được tổng hợp theo hướng
nầy được gọi là sợi muộn (lagging
strand). Ngược
với sợi sớm (được tổng hợp liên
tục), sợi muộn
lúc đầu chỉ tổng hợp các đoạn
ngắn, gọi là các đoạn Okazaki (R. Okazaki, người
Nhật tìm ra). Ở nhóm
chân hạch, mỗi đoạn có khoảng 1.000 đến
2.000 nucleotid. Sau đó
một enzim là ligaz sẽ nối các đoạn Okazaki
lại với nhau.
Một điều cần lưu ý là nucleotid
phải được gắn vào đầu một
đoạn đã có sẵn gọi là đoạn
mồi (primer). Ðoạn
mồi là một đoạn ngắn ARN.
Ở các tế bào chân hạch, khoảng 10
nucleotid được kết hợp với nhau nhờ
enzim primaz để tạo thành đoạn mồi.
Chỉ cần một đoạn mồi để
polymeraz bắt đầu tổng hợp sợi tổng
hợp sớm của ADN mới.
Ðối với sợi tổng hợp muộn,
mỗi đoạn Okazaki được tổng hợp
cần có một đoạn mồi.
Sau đó enzim ADN polymeraz I sẽ thay thế các
nucleotid của đoạn ARN mồi bằng các nucleotid
và enzim ligaz nối tất cả các đoạn ADN thành
một sợi (Hình 13).
Hình 13. Sơ đồ biểu diễn cơ chế sao chép của ADN
|
|
Ty
thể và lạp thể có nhiều tính chất
giống với nhóm sơ hạch, kể cả
nhiễm sắc thể vòng.
Giả thiết thú vị nhất về sự
giống nhau đó là các bào quan nầy từ xa xưa
là các sinh vật sơ hạch sống tự do rồi
sau đó đến sống cộng sinh với các
tế bào chân hạch sơ khai.
Quan
sát đầu tiên khám phá ra các bào quan có gen riêng
của nó đến từ 1909, khi C.
Correns thông báo ở cây bông phấn Mirabilis jalapa,
nở hoa về đêm, trên lá xanh xuất hiện các
đốm trắng, sự thay đổi màu đó
được chuyển vào tế bào chất của
giao tử cái. Correns
đoán một cách chính xác rằng lạp thể
phải chứa gen và tự sao chép, và sự thay đổi
màu có thể xảy ra khi một hay nhiều gen tham gia vào
sự tổng hợp diệp lục tố bị hư
hỏng. Vì cây không
thể sống mà không có lục lạp chức năng,
sự đột biến đã xảy ra trên một
số lục lạp của cây có hôût (hạt phấn
không có lục lạp). Trong
khi phân bào ở các lá đang phát triển, do ngẫu
nhiên một số tế bào nhận lục lạp mang
gen đột biến, các tế bào con được
tạo ra từ tế bào thiếu lục lạp
xuất hiện như một vệt dài trên lá.
Bằng chứng đầu tiên về gen của ty
thể có được vào năm 1938 khi T.
M. Sonneborn khám phá
ra các dòng Paramecium aurelia có một gen trong nguyên sinh
chất sản xuất
ra một độc chất (lúc đầu gen nầy
được gọi là yếu tố Kappa) giết
chết các dòng khác. Sau
đó người ta biết rõ rằng độc
chất đó là do gen của ty thể.
Giống như lục lạp, ty thể tự sao
chép và được di truyền từ con cái (tạo
trứng) trong tất cả các loài.
Bây giờ chúng ta biết rằng sự sao chép ADN và sự phân cắt của ty thể cũng như lục lạp độc lập với sự sao chép của nhiễm sắc thể. ADN của ty thể và lục lạp hầu như luôn luôn hình vòng, ngoại trừ ADN ty thể của 1 số nấm mốc và nguyên sinh động vật hình sợi. Mỗi bào quan có một số bản sao ADN, và ADN nầy giống với ADN nhóm sơ hạch hơn là ADN nhân của nhóm chân hạch. Tuy nhiên, nó có ít cặp baz hơn ADN vi khuẩn. Chẳng hạn nhiễm sắc thể của E. coli mã hóa khoảng 300 sản phẩm trong khi gen ty thể ở động vật mã hóa độ 40. Với số nầy thì không đủ để tổng hợp bào quan và vận hành (ở vi khuẩn, ít nhất 90 gen cần thiết để sao chép, phiên mã và giải mã). Do đó trong quá trình tiến hóa, những gen cần thiết để bào quan hoạt động được chuyển vào trong nhân tế bào.
Sự
sao chép chính xác ADN là chức năng cơ bản
của tế bào. Các
đột biến (những thay đổi ngẫu nhiên
trong gen) thường làm gián đoạn quá trình này
bằng cách phá hủy kiến trúc tinh vi của enzim.
Thông tin di truyền để tổng hợp protein
cấu trúc, enzim, protein điều hòa...
có hàng trăm hoặc hàng ngàn baz, tỉ lệ sai
sót dù thấp (1 trên 1.000 baz), dường như không có
ý nghĩa nhưng hậu quả lại rất lớn.
Do đó ở nhóm sơ hạch và nhóm chân
hạch đều có những enzim chuyên biệt để
phát hiện và sửa chữa các đột biến.
Các enzim nầy giữ cho khuyết điểm sao
chép ở mức thấp nhất và những enzim khác
định vị và sửa chữa những tổn thương
giữa những đầu sao chép.
Những enzim sửa chữa nầy gắn vào các
nơi bị tổn thương trên ADN bằng
những vị trí hoạt động của nó để
xúc tác tạo ra những đoạn mới.
Tỉ
lệ sai sót của 1 enzim sao chép ở nhóm sơ
hạch và nhóm chân hạch khoảng 3/1İđến
3/109 cặp. Nếu các
sai sót trên không được sửa chữa, sẽ có
khoảng 1.000 protein bị thay đổi trong mỗi
tế bào của người sau mỗi lần sao chép.
May mắn thay, phức hệ ADN polymeraz gồm 1 hay
nhiều enzim đọc kiểm chứng mỗi baz và
nhặt ra những khuyết điểm.
Kế đến, các enzim khác trong phức hệ
polymeraz thay thế baz bổ sung trong mã đó, phức
hệ tiếp tục di chuyển mà không cần
kiểm tra lại lần thứ hai.
Các
thông tin di truyền cũng bị đe dọa do sự
thay đổi trình tự baz bởi nhiệt, phóng
xạ, các hóa chất. Tỉ
lệ đột biến thường cao.
Chẳng hạn năng lượng nhiệt làm gãy
các cầu nối giữa 5.000 purine (adenin và guanin) và 2
trục deoxiriboz ở mỗi tế bào người
mỗi ngày. Cytosin
bị biến đổi thành uracil (nucleotid thường
chỉ gặp ở ARN, và đọc nhầm bởi
enzim sao chép và phiên mã) với tỉ lệ khoảng 100
trong mỗi tế bào trong 1 ngày.
Tia tử ngoại trong ánh sáng mặt trời làm
cho các timin trong biểu bì da dính lại với nhau
ở tỉ lệ cao. Tuy
nhiên, nhờ các enzim sửa sai hoạt động liên
tục nên mức đột biến trong tế bào
vẫn còn thấp hơn những khuyết điểm
không được sửa chữa trong sự sao chép. Cách
sửa chữa các sai sót do đột biến về cơ
bản cũng giống như sự sửa chữa trong
sao chép: enzim định vị, gắn vào các trình
tự sai và nhặt ra rồi sợi bổ sung nguyên
vẹn hướng dẫn sửa chữa.
Có khoảng 50 enzim định vị và sửa
những khuyết điểm nầy.
Dù
hệ thống sửa chữa chặc chẽ, một
số đột biến vẫn tồn tại.
Rõ ràng, không hệ thống enzim nào hoàn chỉnh:
có những khuyết điểm mất đi và
những khuyết điểm khác được
sửa chữa không đúng.
Ngoài ra, có những đột biến xảy ra
ngay trước hoặc trong khi sao chép, không còn kịp
để phát hiện hoặc sửa chữa.
Lại còn có những đột biến gây ra do
hệ thống sửa chữa.
Một
loại đột biến được biết
rất rõ do enzim sửa chữa gây ra gọi là sự xóa
không khớp (misalignment deletion) (Hình14).
Các nghiên cứu gần đây cho thấy sự
mất vài cặp baz không xảy ra ở những
vị trí ngẫu nhiên; một
số cặp baz dễ bị mất hơn những
cặp baz khác. Ðó là
do các liên kết tương đối yếu giữa
các cặp adenin và timin:
chỉ có 2 nối hydro, trong khi giữa guanin và cytosin có
3 nối (Hình 14A). Các
cầu nối hydro liên tục gãy và tái tạo, nó thường
xuyên xảy ra, nhất là ở những vùng có
nhiều cặp adenin-timin (Hình 14B).
Do ngẫu nhiên các cầu nối đó trong
một đoạn ADN nhỏ bị gãy cùng một lúc.
Các cầu nối tái tạo tự nhiên nhưng
thỉnh thoảng sự tái tạo cầu nối
lại không đúng. Thí dụ khi một đoạn có
nhiều cặp adenin- timin đang tách nhau ra tạm
thời, có thể xảy ra sự việc hai sợi không
khớp khi chúng bắt cặp lại (Hình 14C).
Enzim sửa chữa dời những baz không bắt
cặp tạo ra sự không khớp (Hình 14D-E).
Sự sửa chữa nầy làm thay đổi ý
nghĩa của gen, tạo ra những khuyết điểm
trong sự giải mã mARN
của gen.
|
|
Hình
14. Sự xóa không
khớp
Sau cùng, một số đột biến không
thể phát hiện được bởi các enzim
sửa chữa. Thí
dụ: cytosin khi nhận thêm nhóm methyl 
tạo ra timin. Nhưng
vì timin là một trong bốn loại baz nên không có cách
nào để xác định baz không đúng là timin (Hình
15).
Cytosin
Cytosin bị
Timin
methyl
hóa
Hình 15. Sự khử amin của Cytosin bị methyl hóa.
